藏獒（Canis lupus familiaris，Tibetan Mastiff）是青藏高原历史悠久、广泛分布的伴侣动物，在产地牧业生产和群众生活中发挥了重要的作用，被誉为“草原的保护神”。因其体形高大、体格强壮、肌肉发达等特点深受各地人民喜爱。但由于错误选择、盲目饲养、混乱杂交以及非理性商业炒作等原因，上世纪80-90年代的“藏獒热”造成藏獒产地种群资源流失，品种资源保护受到严重威胁。评估藏獒遗传多样性与基因污染程度显得愈发重要。

图1. 著名清代宫廷画家郎世宁《十骏犬之苍猊图》描绘的藏獒外形

图2. 现代藏獒丰富表型

线粒体DNA（mtDNA）是评估遗传多样性的有效工具。研究团队前期开发家养动物线粒体单倍型分析软件（MitoToolPy）和单倍型类群谱系树（DomeTree），为快速分析家养动物mtDNA遗传多样性提供了便利。目前的一、二代测序受限于测序读长，在实验操作中存在诸多不便。三代长片段测序结合长片段PCR扩增提供了一种高效的解决方案。然而，三代测序存在过高的测序错误率。虽然使用二代测序数据进行纠正，但无疑增加了测序成本和分析工作量。近年来，PacBio高保真(HiFi)测序的推出，使得纯三代测序成为可能。

青藏高原重要畜禽种质资源遗传多样性科考分队（2019QZKK05010701）基于PacBio三代测序平台开发了长扩增子高保真(HiFi)多样本混合测序流程（图3）。研究采用长片段PCR扩增（Long-rang PCR）分两段扩增出完整的mtDNA基因组；运用两轮一致性序列（CCS）生成的方法对测序数据进行了分析及评估。结果显示，经过两轮HiFi CCS数据质量和准确率（>Q50）显著提高。以上改良流程以及分析工具HQGR（https://github.com/Caizf-script/HQGR）可用于大样本量的小型基因组（例如病毒基因组）或候选基因片段测序和数据分析。

图3. HiFi长扩增子混合测序及分析流程

为评估藏獒遗传多样性，团队对采集自青藏高原核心产区、青藏高原周边、中国南方和北方地区共计79份藏獒样品，开展 mtDNA基因组HiFi混合测序。系统发育分析发现相较于藏獒的原产地青藏高原及其周边地区，远离青藏高原地区的中国南方和北方地区藏獒经历了与其他家犬品种的杂交，存在明显的基因污染（图4）。该结果表明mtDNA基因组分析能为青藏高原家养动物种质遗传资源评估提供重要的信息。

图4. 79只藏獒线粒体基因组单倍型类群地域分布

本研究使用的动物遗传资源保存于第二次青藏科考动物资源官方保藏平台中国西南野生生物种质资源库动物种质资源库。相关成果于2023年2月9日以 “Long amplicon HiFi sequencing for mitochondrial DNA genomes”为题发表在Molecular Ecology Resources期刊（链接https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1755-0998.13765）。云南大学蔡正飞、胡继元、 尹婷婷高级工程师为论文共同第一作者， 张亚平研究员、彭旻晟研究员为共同通讯作者。该研究得到第二次青藏高原综合科学考察研究（2019QZKK05010701）、国家自然科学基金（32001091）、云南省青年基金（202001AU070099）、昆明市春城计划（2022SCP001）以及中国西南野生生物种质资源库动物种质资源库(国家重大科技基础设施专项)的支持。